Джесси родился в Куинсе в еврейской семье выходцев из Украины и Польши. Его мать Эми Фишман работала клоуном, а отец Барри Айзенберг был администратором в больнице, позже занял должность профессора в колледже. У Айзенберга есть две родные сестры: старшая — Керри Ли и младшая — Хэлли Кейт — бывшая актриса детских ролей. Джесси рос в Куинсе и Нью-Джерси, посещал Ист-Брунсвикские государственные школы, позже перейдя на второй курс высшей школы. Первоначально Айзенберг хотел поступать в Нью-Йоркский университет, но передумал, чтобы завершить свою роль в фильме. Впоследствии он поступил в университет «Новая школа».

В 1996 году Джесси Айзенберг стал членом популярной музыкальной группы «The Broadway Kids» и выступал в бродвейских мюзиклах. В этом же году дебютиривал на Бродвее в постановке «Лето и дым». В 1999 году, ещё учась в школе, получил роль в телевизионном сериале «Будь собой», где вместе с ним дебютировала актриса Энн Хэтэуэй. В 2001 году снялся в телевизионном фильме «Молния: Огонь с небес», за ним последовал независимый фильм «Любимец женщин», за роль в котором Джесси получил приз на кинофестивале в Сан-Диего как «Самый многообещающий новый актёр». Следующей работой Айзенберга стал фильм «Императорский клуб», вышедший в 2002 году.

В 2005 году снялся в фильме ужасов Уэса Крэйвена «Оборотни» и в независимой драме «Кальмар и кит». Следующие два года Джесси, в основном, работал в театре, а в 2007 году снялся вместе с Ричардом Гиром в триллере «Охота Ханта», в котором сыграл журналиста.

В 2009 году вместе с Кристен Стюарт сыграл в молодёжной комедии «Парк культуры и отдыха», премьера которой состоялась на кинофестивале «Сандэнс». В этом же году вышел комедийный фильм ужасов «Добро пожаловать в Zомбилэнд», принёсший Джесси большую популярность. В 2010 году вместе со своей сестрой Хэлли снялся в драме «Святые роллеры», где сыграл еврея-хасида. В этом же году вышел фильм «Социальная сеть», где актёр сыграл основателя сайта «Facebook» Марка Цукерберга. За роль в этом фильме Джесси был номинирован на премии «Золотой глобус» и «Оскар».

В 2011 году Джесси появился в качестве ведущего и приглашённой звезды в 13 эпизоде 36 сезона юмористического телешоу «Saturday Night Live». В 2012 году снялся в драме «Си-бемоль-кокос» и в комедии Вуди Аллена «Римские приключения». В 2013 году Джесси сыграл в криминальном триллере об иллюзионистах — «Иллюзия обмана». В 2015 году вышел комедийный боевик «Ультраамериканцы».

В 2016 году Джесси появился в новом фильме DC Universe — «Бэтмен против Супермена: На заре справедливости», в котором сыграл суперзлодея Лекса Лютора. В том же году сыграл иллюзиониста Дэниела Атласа в «Иллюзия обмана 2».

Писатель

В качестве драматурга, Айзенберг написал пьесы «Асунсьон» и «Ревизионист». В октябре 2011 года по пьесе «Асунсьон» был поставлен спектакль, в котором актёр сыграл одну из главных ролей вместе с Джастином Барта и Камиль Мена. В 2013 году по пьесе Айзенберга был поставлен спектакль «Ревизионист», где вместе с ним сыграла Ванесса Редгрейв.

Помимо работы над пьесами, Джесси пишет сатиристические рассказы, которые он публикует на сайте журнала The New Yorker и на сайте McSweeneys.net.

Личная жизнь

Джесси является создателем сайта OneUpMe.com, специализирующегося на игре со словами. Любимая музыкальная группа Джесси — Ween, в частности их альбом «Chocolate and Cheese».

C 2002 по 2012 год встречался с Анной Страут, которая старше Джесси на шесть лет. С ней он познакомился на съёмках фильма «Императорский клуб», где Анна работала ассистентом продюсера. С 2013 по 2015 год встречался с актрисой Мией Васиковска, партнёршей по фильму «Двойник».

В 2015 году снова вступил в отношения с Анной Страут. В 2017 году у них родился сын.